免疫檢查點(diǎn)阻斷(icb)、個(gè)性化腫瘤疫苗和溶瘤病毒療法等免疫療法的出現(xiàn)是抗腫瘤治療史上的一個(gè)里程碑。不幸的是，免疫治療只對(duì)有限的癌癥類型有效，患者很可能在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生耐藥性。最近的研究表明，在大多數(shù)實(shí)體癌中，高的腫瘤突變負(fù)荷不能作為預(yù)測icb應(yīng)答的精確生物標(biāo)志物。因此，需要免疫治療結(jié)果的預(yù)測性生物標(biāo)志物。然而，對(duì)于免疫治療如何改變免疫微環(huán)境，以及它如何通過腫瘤-非腫瘤細(xì)胞相互作用發(fā)揮作用，我們知之甚少。腫瘤浸潤性淋巴細(xì)胞(tils)是腫瘤微環(huán)境(tumor    microenvironment，    tme)的重要組成部分，影響預(yù)后和臨床特征，在腫瘤免疫治療中發(fā)揮基礎(chǔ)性作用。因此，對(duì)tils進(jìn)行全面、動(dòng)態(tài)的監(jiān)測有助于進(jìn)一步探索腫瘤免疫治療的邊界。

    測序技術(shù)為細(xì)胞生物學(xué)、疾病病原學(xué)和藥物反應(yīng)提供了新的見解。批量測序研究以整個(gè)腫瘤為靶點(diǎn)，分析腫瘤內(nèi)細(xì)胞的平均基因表達(dá)。然而，反映tme潛在異質(zhì)性和可塑性的特定功能亞群可能被忽視。腫瘤主要由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞組成，這些細(xì)胞可分為不同的亞型。這些細(xì)胞構(gòu)成了腫瘤異質(zhì)性，在腫瘤進(jìn)展中起主要作用。scrna-seq的存在可以通過分析和量化單個(gè)細(xì)胞的整個(gè)轉(zhuǎn)錄組來探索腫瘤異質(zhì)性。對(duì)于單個(gè)細(xì)胞，其遺傳學(xué)和表觀遺傳學(xué)被揭示來預(yù)測其在癌癥中的作用和對(duì)治療的反應(yīng)。此外，基于單個(gè)細(xì)胞的空間轉(zhuǎn)錄揭示了單個(gè)細(xì)胞在原始腫瘤中的空間位置和細(xì)胞間通訊的局部網(wǎng)絡(luò)。

    最近，許多癌癥類型的免疫環(huán)境，如黑色素瘤，乳腺癌，肝癌，非小細(xì)胞肺癌，已經(jīng)被scrna-seq揭示，其中t細(xì)胞，b細(xì)胞，骨髓源性抑制細(xì)胞(mdscs)，樹突狀細(xì)胞，它們分泌的細(xì)胞因子/趨化因子構(gòu)成了一個(gè)復(fù)雜的相互作用網(wǎng)絡(luò)。令人印象深刻的是，t細(xì)胞一直是研究抗腫瘤功能的主要焦點(diǎn)，包括na?ve    t細(xì)胞、效應(yīng)記憶t細(xì)胞、衰竭t細(xì)胞、調(diào)節(jié)性t    (treg)細(xì)胞和居住記憶t細(xì)胞，這些在幾種癌癥中都有描述。b細(xì)胞作為體液免疫的主要效應(yīng)體，在tme成分和免疫治療反應(yīng)中也有顯著作用。大量rna測序顯示，b細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記物在免疫治療應(yīng)答者和非應(yīng)答者之間表達(dá)差異最大。b細(xì)胞以三種方式攻擊癌癥:1.分泌免疫球蛋白介導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞毒性(adcc)、抗體依賴性細(xì)胞吞噬作用(adcp)和補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性(cdc);    2.抗原提呈激活t細(xì)胞;    3.分泌granzyme    b、腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體(trail)和ifnγ直接殺傷腫瘤細(xì)胞。因此，腫瘤浸潤b細(xì)胞(til-bs)可能對(duì)腫瘤預(yù)后有重要意義，并可作為預(yù)測免疫治療的生物標(biāo)志物。然而，專注于b細(xì)胞的研究比專注于t細(xì)胞的研究要少得多，這使得它們?cè)诎┌Y免疫治療中的復(fù)雜機(jī)制不清楚。隨著scrna-seq技術(shù)的發(fā)展，til-bs的位置和功能可以被精確地確定，這可能有助于更好地理解其機(jī)制。從單細(xì)胞的角度來看，在本文中，我們討論til-bs亞種群分化軌跡，與其他細(xì)胞的相互作用，并總結(jié)b細(xì)胞的機(jī)制調(diào)節(jié)時(shí)間和影響免疫治療效果，旨在為腫瘤研究提供一種新的方式針對(duì)b細(xì)胞。

    單細(xì)胞測序可以進(jìn)一步探索腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。與流式細(xì)胞術(shù)、質(zhì)譜法或其他任何以前的方法不同，單細(xì)胞測序是一種連續(xù)的方法，而不是離散的方法。scrna-seq的步驟主要包括以下四個(gè)步驟:(1)單細(xì)胞分離，(2)反轉(zhuǎn)錄成cdna，(3)    pcr擴(kuò)增cdna，(4)測序庫構(gòu)建(圖1a)。熒光激活細(xì)胞分選(facs)可用于從組織中分離特定的細(xì)胞(圖1a)。在b細(xì)胞研究方面，采用流式細(xì)胞術(shù)篩選cd45+細(xì)胞，增加b細(xì)胞的比例；也可根據(jù)b細(xì)胞標(biāo)記物直接選擇靶向b細(xì)胞。作為scrna-seq技術(shù)的突破，微流控系統(tǒng)將單個(gè)細(xì)胞封裝在獨(dú)立的微液滴中，該微液滴包含一個(gè)獨(dú)特的分子標(biāo)識(shí)符(umi)，用于對(duì)單細(xì)胞內(nèi)的微轉(zhuǎn)錄材料進(jìn)行條形碼。根據(jù)每個(gè)細(xì)胞的umi，即使細(xì)胞被裂解，在后續(xù)的分析中也可以找到轉(zhuǎn)錄信息。基于這一特點(diǎn)，10×    genomics    chromium平臺(tái)同時(shí)測序數(shù)千個(gè)細(xì)胞。與smart-seq    2等低通量方法相比，10×    genomics    chromium平臺(tái)因其成本低、效率高而被更廣泛地應(yīng)用于b細(xì)胞檢測。

    在對(duì)多種scrna-seq方法的比較研究中，10×    genomics也比其他高通量方法如drop-seq和indrops[33]具有更高的靈敏度，更高的與線粒體基因匹配的reads比例，更低的噪聲。利用10×    genomics和smart-seq2平臺(tái)，可以通過不同的免疫球蛋白重鏈特征區(qū)分crc中b細(xì)胞的亞群，聚類結(jié)果無明顯差異。但是，10×    genomics也有不足之處，它不能覆蓋所有的基因，并且存在3    '區(qū)域偏倚，在檢測基因突變或mrna剪接位點(diǎn)時(shí)可能會(huì)遺漏一些重要信息。此外，這種方法對(duì)細(xì)胞質(zhì)量有更高的要求，不同的組織和不同的獲取樣本的方法都不同。利用scrna-seq，我們可以更精確地定義細(xì)胞的亞型，追蹤它們的發(fā)育譜系，確定克隆型和表現(xiàn)型之間的關(guān)系，繪制不同細(xì)胞之間的相互作用和空間關(guān)系圖，從而從多個(gè)維度描述tme。此外，還需要通過一系列體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證結(jié)果。我們總結(jié)了使用scrna-seq研究的最新出版物

    b細(xì)胞受體(b    cell    receptor，    bcr)是一種能識(shí)別并結(jié)合特異性抗原的膜免疫球蛋白，在b細(xì)胞的分化成熟過程中起著重要作用。bcr由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，其中可變(v)、多樣性(d)和連接(j)基因序列的重組創(chuàng)造了b細(xì)胞的多樣性。這種多基因的復(fù)雜性使得鑒別不同的受體變得困難。然而，由于每個(gè)b細(xì)胞通常表達(dá)一個(gè)單一的受體，潛在的抗原特異性受體可以通過給定的原細(xì)胞鏈發(fā)現(xiàn)。bcr的兩個(gè)主要功能如下。首先，它通過誘導(dǎo)b細(xì)胞激活過程中肌動(dòng)蛋白骨架的實(shí)質(zhì)改變和各種基因的表達(dá)來激活b細(xì)胞。其次，它介導(dǎo)抗原的鑒定和提取，從而導(dǎo)致加工過的肽在主要組織相容性復(fù)合體ii    (mhc    ii)上呈現(xiàn)給t輔助細(xì)胞。因此，bcr測序有助于進(jìn)一步了解b細(xì)胞分化的軌跡及其特異性識(shí)別抗原性的機(jī)制，特別是當(dāng)與單個(gè)b細(xì)胞的完整轉(zhuǎn)錄組身份配對(duì)時(shí)，這為了解癌癥的發(fā)展提供了線索。更重要的是，bcr測序可以追蹤來自單細(xì)胞的群體，揭示克隆型和表型之間的關(guān)系。scrna-seq技術(shù)在bcr測序中具有天然優(yōu)勢，因?yàn)楹衭mi的微流控系統(tǒng)可以保證同源vh-vl配對(duì)的保存，而這些同源vh-vl配對(duì)在b細(xì)胞批量測序中可能會(huì)丟失。basic是一個(gè)在單細(xì)胞分辨率上進(jìn)行bcr測序的平臺(tái)。作為重建配對(duì)全長bcr序列的工具，bracer為b細(xì)胞的克隆推斷和譜系追蹤提供了一個(gè)完整的管道。libra-seq是一種高通量的方法，將bcr    se-序列與其同源抗原特異性連接起來，可以用來繪制特定對(duì)象中數(shù)千個(gè)b細(xì)胞的抗原特異性。

    研究免疫球蛋白以探討體液免疫的復(fù)雜性

    免疫球蛋白存在于腫瘤和血清中，在腫瘤中起雙重作用。抗體通過其片段可結(jié)晶(fc)支配功能，并受翻譯后修飾調(diào)控。通常，免疫球蛋白是由骨髓和脾臟的漿細(xì)胞(pcs)分泌的。組織炎癥區(qū)域和腫瘤內(nèi)部的pc，特別是在三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)(tls)中，分泌腫瘤相關(guān)抗體并直接在腫瘤上誘導(dǎo)原位效應(yīng)。在抗腫瘤功能方面，igg是最重要的一類人免疫球蛋白，因?yàn)樗軌蚪Y(jié)合巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞上的fcγ受體，并促進(jìn)adcc、adcp和cdc的作用。此外，igg對(duì)抗原處理和呈遞至關(guān)重要，因?yàn)榭乖蔬f細(xì)胞(apcs)上的fcγ受體可以與igg包被的免疫復(fù)合物結(jié)合，激活t細(xì)胞。抗體和抗體分泌細(xì)胞(apcs)的單細(xì)胞測序有助于進(jìn)一步明確b細(xì)胞體液免疫的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)。已經(jīng)報(bào)道了一種單細(xì)胞液滴微流控測序方案，用于特異性結(jié)合靶細(xì)胞的抗體，這也適用于初級(jí)人類pc。celligo是一種液滴微流體系統(tǒng)，用于高通量單細(xì)胞篩選分泌igg的原代細(xì)胞，一方面，通過基于熒光的液滴內(nèi)單細(xì)胞生物測定檢測igg活性，另一方面，用barcoded反轉(zhuǎn)錄對(duì)配對(duì)的v基因進(jìn)行測序。

    外周血未成熟b細(xì)胞通過高內(nèi)皮靜脈進(jìn)入b淋巴濾泡。在b細(xì)胞濾泡中，na?ve    b細(xì)胞(cd27)通過固有apc(包括dcs和濾泡樹突狀細(xì)胞(fdcs))接觸抗原，之后激活bcr信號(hào)誘導(dǎo)抗原提取、內(nèi)化和加工，將肽呈現(xiàn)在mhc    ii上。然后，b細(xì)胞遷移到與t細(xì)胞相鄰的濾泡區(qū)邊緣，將抗原呈遞給濾泡輔助t    (tfh)細(xì)胞。因此，tfh細(xì)胞刺激bcr，誘導(dǎo)na?ve    b細(xì)胞分化，主要包括記憶b細(xì)胞(mbcs)、短命b細(xì)胞(short    -    lived    pcs)和生發(fā)中心(germinal    center，    gc)    b細(xì)胞。這些不依賴gc的mbcs表達(dá)rgs13，可能增加gc抗性。此外，它們?nèi)狈細(xì)胞進(jìn)入和離開gcs的ccr7和gpr183。為了分化為gc    b細(xì)胞，它們首先進(jìn)入gc的暗區(qū)(dark    zone，    dz)，在那里它們的膜表面免疫球蛋白通過體細(xì)胞高突變(somatic    hypermutation，    shm)發(fā)生變化，稱為親和成熟。接下來，它們?cè)诹羺^(qū)(lz)經(jīng)歷一個(gè)競爭過程，在那里許多b細(xì)胞聚集，它們的命運(yùn)取決于它們與tfh細(xì)胞的相互作用，可能有能力捕獲和呈現(xiàn)抗原，并發(fā)生類轉(zhuǎn)換重組(csr)。這個(gè)過程也依賴于tfh細(xì)胞分化的結(jié)果，導(dǎo)致b細(xì)胞的結(jié)果。低親和性b細(xì)胞成為長壽命mbcs，高親和性b細(xì)胞成為pcs，其他細(xì)胞凋亡或重新進(jìn)入****z進(jìn)行shm和克隆擴(kuò)增。最近的研究表明，cmyc+    lz    b細(xì)胞亞群包括親和力較高的pc前體或未來的dz進(jìn)入者，以及一些親和力較低的mbc前體。值得注意的是，bcr在這個(gè)過程中起主要作用，b細(xì)胞分化的體液免疫過程中兩個(gè)重要的檢查點(diǎn)是na?ve    b細(xì)胞和gc    b細(xì)胞上的抗原提呈，這可能會(huì)提高體液免疫應(yīng)答。此外，在單細(xì)胞水平上的完整轉(zhuǎn)錄組字符化將特別有助于確定na?ve    b細(xì)胞向pc分化過程中的轉(zhuǎn)錄軌跡和異質(zhì)性。

    b細(xì)胞分布不均一

    以往對(duì)b細(xì)胞的研究主要基于免疫組化或流式細(xì)胞術(shù)，限制了b細(xì)胞的清晰分類。wouters等人回顧了69項(xiàng)研究，研究tilb在19種癌癥中的預(yù)后意義，以探索b細(xì)胞對(duì)抗腫瘤免疫貢獻(xiàn)的不確定性，其中b系細(xì)胞的預(yù)后意義不同。有研究發(fā)現(xiàn)b細(xì)胞激活髓樣細(xì)胞上的fcrγ受體，促進(jìn)鱗狀細(xì)胞的癌變。然而，帶有抗cd20抗體的b細(xì)胞耗竭促進(jìn)小鼠中黑色素瘤的發(fā)生。到目前為止，b細(xì)胞在腫瘤中的功能尚不清楚。這主要是由于在不同的組織中存在不同的b細(xì)胞亞群，在分類、功能和空間上。scrna-seq的應(yīng)用提供了高分辨率，可以揭示不同組織間分布的不確定性和不均勻性，從而揭示免疫原性或免疫抑制性tme。通常，b細(xì)胞只占正常人體器官細(xì)胞組成的一小部分。例如，b細(xì)胞在正常胰腺組織中是有限的(<1%)，但在胰腺癌中約占5%。在原發(fā)肺腫瘤中，b細(xì)胞也比正常肺組織增加。此外，正常肺組織中浸潤的多為分泌granzyme    b的細(xì)胞毒b細(xì)胞，而在原發(fā)性肺腫瘤和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中，由于腫瘤抗原的克隆擴(kuò)增和生成，不同bcr的gc    b細(xì)胞增多。同樣，與正常乳腺組織相比，原發(fā)性乳腺癌中til-bs密度增加。此外，在乳腺癌中，til-bs比b細(xì)胞在次級(jí)淋巴組織中表達(dá)更多的th1效應(yīng)細(xì)胞因子(ifng和tnfa)，提示1型細(xì)胞免疫應(yīng)答。在一個(gè)三陰性乳腺癌(tnbc)隊(duì)列中，scrna-seq證據(jù)顯示，tme中的b細(xì)胞具有更多的shm和csr的mbcs特征，而pbmcs則富含更多的na?ve    b細(xì)胞。這可能是因?yàn)樵l(fā)性腫瘤發(fā)生時(shí)，外周血中大量na?ve    b細(xì)胞受到高質(zhì)量腫瘤新抗原的刺激，在gcs中發(fā)生shm，從而遷移到tme或tls。然而，通過scrna-seq分析，與癌旁組織和癌前組織相比，人類crc組織的增殖狀態(tài)更高，分散程度更高，mhc    ii類基因評(píng)分更低，抗原呈遞能力更低，提示crc存在不同的免疫抑制tme。