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    放療(rt)是肺癌必不可少的治療方式。對于不適合手術(shù)的iiia    和    iiib    期肺癌患者，根治性放化療是治療標(biāo)準(zhǔn)，這一點(diǎn)已被廣泛接受。不幸的是，放療后腫瘤的再生長是成功控制疾病的主要障礙。

    臨床前研究表明，放療對原發(fā)部位和轉(zhuǎn)移部位的腫瘤免疫微環(huán)境具有雙重作用。一方面，局部照射有可能激活針對遠(yuǎn)離照射區(qū)域的腫瘤細(xì)胞的全身免疫反應(yīng)，即遠(yuǎn)隔效應(yīng)，由mole    在    1953    年首次報(bào)道。rt促進(jìn)腫瘤抗原從垂死的腫瘤細(xì)胞中釋放，上調(diào)mhc    i    類表達(dá)，并增加多種細(xì)胞因子和免疫效應(yīng)分子的表達(dá)，包括白細(xì)胞介素(il)-1、細(xì)胞間粘附分子    1    (icam1)和血管細(xì)胞粘附分子1    (vcam1)，所有這些都有助于由輻射引發(fā)的持久和全身抗腫瘤免疫。另一方面，放療促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的免疫逃避。例如，rt上調(diào)多種免疫抑制細(xì)胞因子的表達(dá)，如腫瘤壞死因子-α(tnf-α)、il-6、il-10    和轉(zhuǎn)化生長因子-β(tgf-β)。rt    促進(jìn)免疫抑制細(xì)胞的積累，例如腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tam)、調(diào)節(jié)性t    (treg)細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞(mdsc)。輻射增強(qiáng)免疫檢查點(diǎn)的活性，如程序性細(xì)胞死亡蛋白1    (pd-1)/pd-l1、細(xì)胞毒性    t    淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4    (ctla4)、t    細(xì)胞免疫球蛋白和含粘蛋白結(jié)構(gòu)域的蛋白3    (tim3)，和淋巴細(xì)胞激活基因3    (lag3)。

    為了克服放療的免疫抑制作用，已經(jīng)提出并測試了免疫療法和放療的各種組合。在    pacific    研究中，標(biāo)準(zhǔn)放化療后加入durvalumab可延長iii    期    nsclc    患者的無進(jìn)展生存期和總生存期。pacific    研究的巨大成功不僅改變了iii    期非小細(xì)胞肺癌的臨床指南，也引起了其他免疫療法與rt    結(jié)合的極大興趣。

    mdscs的積累和激活在免疫抑制的建立中起關(guān)鍵作用。rt    對    mdscs    的確切影響是復(fù)雜的。大分割照射(20    gy)抑制    mdscs    的積累和浸潤，而較低劑量的照射往往會促進(jìn)    mdscs    募集到腫瘤中。此外，臨床前和臨床研究表明，胃腸道腫瘤，包括結(jié)直腸癌和肝癌，在放療后相對容易出現(xiàn)mdscs    水平降低，而在其他腫瘤模型和臨床環(huán)境中，如膠質(zhì)瘤、肺癌、乳腺癌、頭頸部鱗癌、前列腺癌和宮頸癌，導(dǎo)致mdsc    數(shù)量持續(xù)增加。蔡等人首次報(bào)道    mdscs的    pd-l1    表達(dá)被輻照上調(diào)。然而，關(guān)于mdscs    的確切作用，尤其是其潛在機(jī)制，在輻照后塑造tme    方面知之甚少。

    mdscs是一組具有強(qiáng)大免疫抑制能力的異質(zhì)髓細(xì)胞。根據(jù)表型和形態(tài)，mdscs又可分為多形核mdscs(pmn-mdscs，又稱粒細(xì)胞型mdscs)和單核型mdscs(m-mdscs)。

    免疫抑制活性是mdscs的關(guān)鍵標(biāo)志。mdscs的抑制機(jī)制包括誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inos)、精氨酸酶1(arg1)和吲哚胺2，3-雙加氧酶(ido)的表達(dá)，以及一氧化氮(no)和活性氧(ros)的產(chǎn)生。這些不同的機(jī)制不會同時(shí)起作用。人們普遍認(rèn)為pmn-mdscs和m-mdscs通過不同的機(jī)制調(diào)控tme。此外，pd-l1的上調(diào)也被認(rèn)為是輻射招募mdscs的免疫抑制機(jī)制之一。目前，對于輻照誘導(dǎo)的mdscs對tme的影響及放療的治療效果尚無一致的結(jié)論。

    磷酸二酯酶-5(pde5)抑制劑，如西地那非和他達(dá)拉非，可以阻斷環(huán)磷酸鳥苷(cgmp)的水解。最新數(shù)據(jù)表明，pde5    抑制劑能夠通過抑制荷瘤(tb)小鼠和患者mdsc    中inos    和    arg1的活性和表達(dá)來促進(jìn)抗腫瘤免疫。然而，pde5    抑制劑如何影響mdsc    的亞群以及rt    和    pde5    抑制劑的組合是否會延遲輻射后的腫瘤再生尚未得到測試。

    我們最近的研究表明，消除招募的mdsc    會延遲放療后路易斯肺癌(llc)的再生。在這里，我們報(bào)告了局部照射通過促進(jìn)pmn-mdsc    的增殖及其隨后向tme    的募集而削弱了抗腫瘤免疫力。arg1的上調(diào)和激活是照射后pmn-mdscs介導(dǎo)的t細(xì)胞抑制的主要機(jī)制。西地那非與放療的組合通過抑制    arg1    過表達(dá)和    pmn-mdsc    募集消除了輻射衍生的免疫抑制。

    在tb    小鼠和癌癥患者中，mdscs隨著腫瘤的生長而擴(kuò)增。mdscs    的兩個(gè)亞群之間的比例取決于特定的腫瘤模型和微環(huán)境。為了監(jiān)測同源llc    模型中mdsc    的豐度，我們通過免疫表型分析確定了接種后腫瘤的生長以及l(fā)lc    小鼠中不同時(shí)間點(diǎn)的總體mdsc    及其亞群。

    如圖1c所示，腫瘤組織中總mdscs的百分比隨著腫瘤的發(fā)展而穩(wěn)步增加，從接種后第一周腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞的不到10%（5.84±1.22%）上升到第四周超過20%（21.71±    3.22%）（p<0.01）。在我們的llc    模型中，pmn-mdscs占總mdscs    的    94.94    ±8.47%，并且與總mdscs    具有相同的腫瘤發(fā)展趨勢（p    <    0.05）。對亞群進(jìn)行分析，雖然m-mdscs    增加了大約5    倍，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    為了更好地了解mdscs    的全身分布，我們還研究了mdscs    在外周血、脾臟和骨髓中的比例。僅在接種llc細(xì)胞一周后，tb小鼠外周血中的mdsc百分比是無瘤小鼠的兩倍(27.33±4.62%vs.    12.48±0.93%，    p<0.05)，    3周后的mdsc百分比是無瘤小鼠的5倍(27.33±4.62%    vs.    12.48±0.93%，p<0.05)。tb小鼠外周血中pmn-mdscs的比例也增加，而m-mdscs的比例與腫瘤大小無關(guān)。

    pd-l1    是腫瘤細(xì)胞、mdscs、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞表達(dá)的最重要的檢查點(diǎn)分子之一。為了確定tb    小鼠mdscs    的    pd-l1    表達(dá)是否與健康小鼠不同，我們通過流式細(xì)胞術(shù)測試了mdscs    的    pd-l1    表達(dá)。結(jié)果表明，tme中mdscs上pd-l1的平均熒光強(qiáng)度（mfi）從在    llc    細(xì)胞接種后的第一周386.8±    100.9    a.u逐漸增加到第四周的1，068.0    ±121.8    a.u（    p    <0.01），這表明pd-l1    在我們模型中的mdsc    中具有潛在作用。

    在脾臟和骨髓中，隨著腫瘤的發(fā)展，mdscs的比例也顯著增加，其模式與腫瘤組織和外周血中的mdscs相同。此外，我們在tb小鼠中觀察到明顯的脾腫大，這與我們觀察到的mdscs在脾內(nèi)聚集一致。

    為了確定局部照射對腫瘤生長和mdscs的影響，當(dāng)腫瘤直徑達(dá)到7.5    mm時(shí)，我們使用大分割rt(20    gy/f)治療皮下llc腫瘤。放療導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展延遲長達(dá)一周，在第7至第10天的最小體積約為500mm    3，但此后腫瘤開始再生。根據(jù)放療前后腫瘤生長曲線，我們選擇放療后第3天為再生前生長，放療后1周為腫瘤體積最小時(shí)為再生開始，放療后2周和3周為再生階段。腫瘤組織蘇木精-伊紅染色顯示，與未治療的腫瘤相比，放療后的腫瘤中有更多的浸潤性炎癥細(xì)胞。隨后的cd11b特異性免疫組化染色顯示，大多數(shù)炎癥細(xì)胞是cd11b+髓系細(xì)胞，這表明局部照射可能導(dǎo)致mdscs的積累。為了證實(shí)我們的假設(shè)，我們在局部照射后的不同時(shí)間點(diǎn)對總mdscs和這兩個(gè)亞群進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析。局部照射后，放療后腫瘤浸潤mdscs的比例比未治療腫瘤高2倍(ctrlvs.    rt=21.33±3.29%    vs.    44.10±3.00%，p<0.001)。pmn-mdscs與總mdscs具有相同的增加趨勢(ctrlvs.    rt=16.37±2.47%    vs.    38.66±4.24%，p<0.001)，而m-mdsc比例保持在約0.1%，且與腫瘤大小和治療無關(guān)。外周血情況同腫瘤組織。

    為了確定受照射腫瘤中pmn-mdsc    的逐漸積累是否有助于llc    腫瘤的再生長，或者這種積累是否僅僅是腫瘤生長的結(jié)果，使用抗ly-6g    單克隆抗體來消耗mdsc    .抗ly-6g抗體的應(yīng)用顯著降低了腫瘤部位和外周血中pmn-mdsc的頻率（p<0.05）。此外，用抗    ly-6g    抗體治療大大延遲了照射后的再生，這表明pmn-mdsc的募集對腫瘤再生至關(guān)重要。

    雖然pmn-mdscs利用一系列機(jī)制來抑制抗腫瘤免疫反應(yīng)，這涉及到許多免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子，但對cd8+t細(xì)胞的抑制無疑是最重要的。為了確定rt    后    pmn-mdscs    誘導(dǎo)的免疫抑制是否依賴于cd8    +    t    細(xì)胞，我們通過流式細(xì)胞術(shù)評估了cd8    +    t    細(xì)胞的數(shù)量和功能。

    如圖3d    所示，cd8    +    t    細(xì)胞的百分比隨著照射從11.71±    2.31%下降到2.42    ±0.62%(p<0.01)。pmn-mdsc耗竭逆轉(zhuǎn)了這種下降（rtvs.    rt    +    anti-ly-6g    抗體=    2.42    ±0.62%    vs.    20.12    ±3.92%，p<0.01）。為了更好地了解cd8    +    t    細(xì)胞浸潤腫瘤部位的功能狀態(tài)，我們測量了cd8+    t    細(xì)胞內(nèi)部和表面上ifn-γ、cd28    和    pd-1    的表達(dá)。局部    rt    顯著降低了    cd8    +t    細(xì)胞分泌    ifn-γ的比例，從33.06    4.53%降至13.25    2.08%，并增加了表達(dá)    pd-1    的    cd8    +    t    細(xì)胞的比例（ctrlvs.    rt=253.20±    57.03    au    vs.    538.80    ±98.76）    au，p<0.05）。

    cd28    表達(dá)未觀察到顯著變化。當(dāng)抗ly-6g抗體被給予輻照小鼠時(shí)，ifn-γ分泌達(dá)到與未處理的    llc    小鼠相同的水平（29.74±3.55%），而與輻照小鼠進(jìn)行比較抗ly-6g抗體處理后的pd-1    表達(dá)沒有變化小鼠。因此，在這部分我們建議pmn-mdscs    通過抑制cd8    +    t    細(xì)胞促進(jìn)放療后腫瘤的再生。pmn-mdscs    不僅抑制了tme    中    cd8    +    t    細(xì)胞的數(shù)量，而且還抑制了其活性。

    為了確定輻照誘導(dǎo)mdscs的抑制機(jī)制，我們進(jìn)行了免疫組化染色及inos和arg1活性檢測。腫瘤切片的免疫組化染色顯示，局部rt增強(qiáng)了arg1的表達(dá)，但沒有增強(qiáng)inos的表達(dá)。arg1活性測定表明，局部照射顯著提高了arg1的活性，從0.400.15    u/l提高到3.78    0.39    u/l    ((p<0.01)。相比之下，no熒光標(biāo)記的inos活性檢測顯示，輻照和未處理的腫瘤組織樣本的熒光強(qiáng)度相似。

    pd-l1的表達(dá)是mdscs    的一種新型免疫抑制機(jī)制。然后我們詢問pd-l1    上調(diào)是否是rt    后    mdscs    介導(dǎo)的免疫抑制的機(jī)制之一。通過流式細(xì)胞術(shù)分析輻照后mdsc    中    pd-l1    的表達(dá)。圖4e    顯示，與未處理組相比，受照射腫瘤的mdsc    中的pd-l1    表達(dá)在照射后不久顯著增加（照射后第三天：ctrlvs.    rt=443.9    ±175.3    au    vs.    1328.0    ±324.3    au，p<0.05）.然而，此后pd-l1表達(dá)繼續(xù)下降，局部照射組在照射后第3周顯著低于未治療組（ctrl    vs.    rt=1，465.0±    399.6    au    vs.    407.5±164.8    au，p<0.05）。外周血中mdscs    的    pd-l1    表達(dá)與局部腫瘤部位的表達(dá)趨勢相同。

    以上數(shù)據(jù)表明arg1表達(dá)的上調(diào)是照射后pmn-mdscs抑制功能的合理機(jī)制。然而，不涉及    pd-l1    和    inos的調(diào)節(jié)。為了進(jìn)一步證實(shí)這一假設(shè)，在輻射后通過灌胃給予arg1    抑制劑nor-noha。10    mg/kg/d    nor-noha    有效地將arg1    活性從3.78    0.39    u/l    降低到2.02    0.25    u/l（p<0.01）。

    rt后給予nor-noha顯著增加cd8+t細(xì)胞比例（rt    vs.    rt+nor-noha=2.420.62%    vs.    6.14    0.64，    p<0.01），并伴有腫瘤再生延遲。inos抑制劑1400w    對腫瘤再生長沒有影響。

    我們的結(jié)果表明，rt通過上調(diào)腫瘤內(nèi)pmn-mdsc    的百分比和arg1    活性來促進(jìn)腫瘤免疫逃避。推測抑制pmn-mdscs    及其arg1    活性可能是一種新的抗腫瘤策略是合理的。越來越多的證據(jù)表明，pde5    抑制劑可以抑制tb    小鼠和癌癥患者mdsc    中    inos和    arg1    的活性和表達(dá)。因此，通過灌胃給予西地那非20    mg/kg/d，以研究它是否可以促進(jìn)rt    的抗腫瘤作用并闡明潛在機(jī)制。如圖5b    所示，正如我們預(yù)期的那樣，西地那非延遲了照射后的腫瘤再生長，這與陽性對照nor-noha    相當(dāng)。tme    的免疫特征表明，當(dāng)給予西地那非時(shí)，腫瘤內(nèi)pmn-mdsc    的比例從38.66±4.24%下降到23.57±2.38%。

    此外，西地那非也顯著降低了arg1    的表達(dá)。為了進(jìn)一步檢查西地那非對mdsc    的抑制是否真的導(dǎo)致抗腫瘤免疫增強(qiáng)，我們分析了腫瘤內(nèi)cd8    +    t    細(xì)胞的比例和活性。流式細(xì)胞術(shù)分析表明cd8    +    t    細(xì)胞的百分比從2.42    ±    0.62%增加到7.21    ±    1.22%。

    此外，當(dāng)給予西地那非時(shí)，cd8    +    t    細(xì)胞分泌的ifn-γ也顯著升高。因此，我們證實(shí)pde5    抑制劑西地那非通過調(diào)節(jié)pmn-mdscs    改善了照射后腫瘤免疫微環(huán)境。西地那非聯(lián)合放療可能是提高放療療效的一種有前景的策略。

    工作揭示了pmn-mdscs中arg1通路介導(dǎo)rt后腫瘤再生的新機(jī)制，如圖6所示。我們認(rèn)為，pmn-mdscs是輻照招募的主要亞型，而不是m-mdscs。在廣泛的免疫抑制機(jī)制中，arg1的上調(diào)和激活是pmn-mdscs在放療后抑制cd8+t細(xì)胞的主要機(jī)制。為了克服pmn-mdscs引起的免疫抑制，我們提出并證明，sildenafil和rt聯(lián)合使用降低了pmn-mdscs在tme內(nèi)的募集和免疫抑制作用，激活了cd8+    t細(xì)胞應(yīng)答，導(dǎo)致腫瘤生長延遲。綜上所述，我們的研究結(jié)果為緩解免疫抑制tme以提高rt治療效果提供了一種新的解決方案。雖然所有這些結(jié)果都是在llc小鼠模型中進(jìn)行的，但同樣的機(jī)制是否適用于其他腫瘤模型尚不清楚。此外，在不同的輻射方案下，mdscs及其亞型如何影響tme仍未確定。因此，這些問題還需要進(jìn)一步的研究來解決。