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    遠(yuǎn)隔效應(yīng)是指放射治療(rt)期間或之后放射野外腫瘤的消退，已在各種癌癥中報(bào)道，例如黑色素瘤、腎細(xì)胞癌和乳腺癌。雖然其機(jī)制尚未完全闡明，但遠(yuǎn)隔效應(yīng)可能是由輻射誘導(dǎo)的全身免疫反應(yīng)增強(qiáng)介導(dǎo)的。然而，很少觀察到遠(yuǎn)隔效應(yīng)，可能是因?yàn)榘┘?xì)胞的免疫逃逸機(jī)制，包括免疫檢查點(diǎn)通路的激活。在過(guò)去十年中，新開(kāi)發(fā)的免疫檢查點(diǎn)抑制劑(ici)徹底改變了癌癥治療。隨著可增強(qiáng)針對(duì)癌細(xì)胞的全身免疫反應(yīng)的ici    的出現(xiàn)，結(jié)合ici    和放療的新治療方案有望增強(qiáng)遠(yuǎn)隔效應(yīng)。正在積極研究ici    和    rt    的協(xié)同效應(yīng)，并且在各種報(bào)告中都研究了這種組合增強(qiáng)遠(yuǎn)隔效應(yīng)的潛力。

    肝細(xì)胞癌(hcc)是最常見(jiàn)的原發(fā)性肝癌類(lèi)型，也是世界范圍內(nèi)癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。早期hcc    患者接受切除、肝移植和消融等治療方式的總生存率>60%，而接受化療栓塞或全身治療的晚期    hcc    患者預(yù)后不佳。為了改善這種不良結(jié)果，最近在hcc    治療中加入并建議了新方案，包括考慮使用    ici。因此，各種icis，包括程序性細(xì)胞死亡1    (pd-1)抑制劑、pd配體1    (pd-l1)抑制劑和細(xì)胞毒性t淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白-4    (ctla-    4)抑制劑，在hcc患者中的可行性和安全性正在研究中。然而，報(bào)道的icis的客觀緩解率(orr)僅為15-    20%，仍不令人滿意。此外，最近評(píng)估派姆單抗治療晚期    hcc    患者療效和安全性的    keynote-240試驗(yàn)未能顯示與安慰劑相比在總生存期和無(wú)進(jìn)展生存期的改善方面具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由于其免疫原性引起的遠(yuǎn)隔現(xiàn)象，rt    在用于提高    ici    對(duì)晚期    hcc的療效方面受到了相當(dāng)大的關(guān)注。

    最近在一些臨床前實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)中檢測(cè)了協(xié)同治療在控制原發(fā)性hcc    中的功效。然而，這些先前的研究沒(méi)有使用轉(zhuǎn)移性hcc    模型，而是使用原位模型，這只能觀察    rt    和    ici    對(duì)原發(fā)腫瘤的聯(lián)合作用，而不是遠(yuǎn)隔效應(yīng)。因此，在本研究中，我們旨在使用雙側(cè)小鼠同源hcc    模型研究輻射對(duì)遠(yuǎn)隔現(xiàn)象的作用和免疫學(xué)機(jī)制，以及抗pd-1    抗體對(duì)遠(yuǎn)隔效應(yīng)的影響。

    使用hepa1-6    細(xì)胞建立同系雙側(cè)hcc    小鼠模型（圖1a）。腫瘤生長(zhǎng)曲線顯示，與未照射的腫瘤相比，使用總劑量16    gy分兩次照射而不是在單次使用8    gy更顯著地抑制照射腫瘤生長(zhǎng)（p    <0.001，圖    1b）和未照射的腫瘤生長(zhǎng)（p    <0.05，圖    1c）。對(duì)第31    天收獲的腫瘤進(jìn)行拍照（圖1d），與單次8    gy照射相比，分兩次總劑量16    gy照射顯著提高小鼠的存活率（p    <0.001，圖    1e)。表明在目前的hcc    模型中總劑量16    gy分兩次照射方案適用誘發(fā)遠(yuǎn)隔效應(yīng)。

    為了確定局部照射降低未照射腫瘤大小是否與免疫原性激活有關(guān)，我們對(duì)腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)分析(圖2a，b)。數(shù)據(jù)表明，，而不是單次8    gy顯著增加了cd4    +    ifn-γ+和    cd8    +    ifn-γ+    t    細(xì)胞在照射腫瘤（p    <0.001    和    p    <0.05    ，圖    2c)和未照射的腫瘤（p<0.001    和    p    <0.001，圖    2d）的浸潤(rùn)。此外，總劑量16    gy分兩次照射還增加了受照射腫瘤中調(diào)節(jié)性t    細(xì)胞（treg、cd4    +    cd25    +    foxp3    +）的浸潤(rùn)（p<0.05，圖    2c）。

    為了了解局部照射如何縮小未照射的腫瘤，我們使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了小鼠右后腿的腫瘤引流的腹股溝淋巴結(jié)中的dcs（圖3a、b）。數(shù)據(jù)顯示，總劑量16    gy分兩次照射顯著增加了tdln    中活化dcs比例，這由cd40（p    <0.001）和    cd80（p    <0.01，圖    3c）的高表達(dá)所證明。tdln    中    cd11c    +    dc    上的共抑制分子pd-l1    的表達(dá)也由總劑量16    gy分兩次照射誘導(dǎo)（p    <0.05，圖    3c）。此外，總劑量16    gy分兩次照射顯著增加了cd4+    ifn-γ+和    cd8    +    ifn-γ+    t    細(xì)胞（p    <0.001，圖    3d），激活了tdln    中的t    細(xì)胞。tregs在    tdln    中的積累在總劑量16    gy分兩次照射組中也比單個(gè)8    gy照射組更明顯（圖3d）。

    基于顯示輻射增加tdln    dc    中    pd-l1    表達(dá)的結(jié)果，我們確定了pd-1/pd-l1    通路的阻斷是否可以進(jìn)一步增強(qiáng)同源雙側(cè)hcc    小鼠的遠(yuǎn)隔效應(yīng)模型（圖4a）。抗    pd-1    抗體比同型igg    對(duì)照更能抑制雙側(cè)hepa1    6    腫瘤的生長(zhǎng)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。總劑量16    gy分兩次照射抑制了受輻照（p    <0.001）和未受輻照的遠(yuǎn)側(cè)腫瘤（不顯著）的生長(zhǎng)。與單獨(dú)放療或抗pd-1    單藥治療相比，放療和抗    pd-1    聯(lián)合治療進(jìn)一步抑制了受輻射和未受輻射腫瘤的生長(zhǎng)。用抗pd-1    抗體和輻射聯(lián)合治療的小鼠腫瘤明顯小于用輻射或抗pd-1    單一療法治療的小鼠的腫瘤（圖4d）。單獨(dú)的抗    pd-1    治療并沒(méi)有提高生存率，但與放療相結(jié)合，它顯著提高了生存率（p    <0.001）。

    使用cd4    和    cd8    特異性抗體的免疫組織化學(xué)顯示，與igg    對(duì)照相比，單獨(dú)的抗pd-1    抗體和放療更顯著地增加了cd4    +和    cd8    +細(xì)胞在照射腫瘤中的浸潤(rùn)（p    <0.05），cd4    +細(xì)胞向未放療的對(duì)側(cè)腫瘤的浸潤(rùn)（p    <0.01    和    p    <0.001；補(bǔ)充圖    2c，d）。用抗pd-1    抗體和輻射聯(lián)合治療進(jìn)一步增強(qiáng)了cd8    +細(xì)胞向兩種腫瘤的浸潤(rùn)，盡管沒(méi)有明顯的累加效應(yīng)。

    對(duì)第31    天收獲的腫瘤進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析（圖5a）表明，在受照射的腫瘤中，總劑量16    gy分兩次照射，而不是抗pd-1    抗體治療更顯著增加cd4    +和    cd4    +    ifn-γ+    t    細(xì)胞的浸潤(rùn)（p<0.001，）。類(lèi)似地，總劑量16    gy分兩次照射增加了總cd8    +和    cd8    +    ifn-γ+    t    細(xì)胞的浸潤(rùn)。與單獨(dú)使用抗pd1    抗體而不是單獨(dú)使用輻射相比，用抗pd-1    抗體和輻射聯(lián)合治療進(jìn)一步增強(qiáng)了cd4    +和    cd8    +    t    細(xì)胞的浸潤(rùn)。放療和抗pd-1    抗體均增加了未受照射腫瘤中的cd4    +和    cd4    +    ifn-γ+    t    細(xì)胞，但不增加cd8    +    t    細(xì)胞，而它們的聯(lián)合治療增加了總cd8    +和    cd8    +    ifn-γ+    t    細(xì)胞超過(guò)任何一種單獨(dú)治療。與    igg    對(duì)照治療相比，放射和抗    pd-1    抗體的組合增加了兩側(cè)腫瘤中cd25    +    cd4    +    foxp3    +    tregs    的浸潤(rùn)（p    <0.05    和    p    <0.01），而在各組之間沒(méi)有觀察到cd11c    +    dcs    的差異。

    流式細(xì)胞術(shù)免疫表型分析顯示，cd220+    b    細(xì)胞、f4/80    +巨噬細(xì)胞、ly6******11b    +中性粒細(xì)胞、ly6****11b    +    ly6c    +單核骨髓源性抑制細(xì)胞(mdscs)和    ly6****11b    +    ly6c    low粒細(xì)胞-mdscs    的數(shù)量不受單一療法或聯(lián)合療法的影響，除了cd3    +    t    細(xì)胞。

    遠(yuǎn)隔效應(yīng)是一種由輻射引起的罕見(jiàn)現(xiàn)象，可以通過(guò)免疫療法得到加強(qiáng)。盡管放射療法和免疫療法越來(lái)越多地用于治療肝細(xì)胞癌(hcc)，但免疫療法是否可以增強(qiáng)遠(yuǎn)隔效應(yīng)仍不清楚。在這項(xiàng)研究中，旨在闡明在鼠hcc    模型中由輻射和免疫治療相結(jié)合引起的遠(yuǎn)隔效應(yīng)的免疫學(xué)機(jī)制。通過(guò)將小鼠hepa1    -6hcc    細(xì)胞接種到具有免疫活性的c57bl/6    小鼠的兩條后腿上，建立同源hcc    小鼠模型。右后腿的腫瘤被照射，在左后腿未照射的腫瘤中觀察到遠(yuǎn)隔效應(yīng)，有或沒(méi)有抗程序性細(xì)胞死亡1    (pd-1)抗體的共同給藥。進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析以分析浸潤(rùn)受照射和未受照射的腫瘤以及腫瘤引流淋巴結(jié)(tdln)的免疫細(xì)胞的分布。與單次8gy照射相比，兩次共16gy照射更有效地抑制了受輻射和未受輻射的腫瘤的生長(zhǎng)，細(xì)胞毒性t    細(xì)胞的腫瘤浸潤(rùn)更高。更高的劑量還增加了tdln    中活化的樹(shù)突細(xì)胞，其具有更高的程序性細(xì)胞死亡配體1    的表達(dá)。抗pd-1    抗體的共同給藥顯著增強(qiáng)了遠(yuǎn)隔效應(yīng)，并增加了受照射和非照射的活化細(xì)胞毒性t    細(xì)胞的浸潤(rùn)。受輻射的腫瘤。的研究結(jié)果表明，在放療中加入抗pd-1    療法可增強(qiáng)hcc    同源小鼠模型的遠(yuǎn)隔效應(yīng)。

    紅細(xì)胞的生成是一個(gè)被嚴(yán)格調(diào)控的過(guò)程。在穩(wěn)態(tài)的血細(xì)胞生成過(guò)程中，骨髓每小時(shí)大約產(chǎn)生1010個(gè)紅細(xì)胞，以使血紅蛋白水平維持在一個(gè)很窄的范圍內(nèi)。在持續(xù)失血或溶血的情況下，紅細(xì)胞的生成可快速增加。
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