X-連鎖無丙種球蛋白血癥的研究進展

X-連鎖無丙種球蛋白血癥的研究進展 【摘要】 X-連鎖無丙種球蛋白血癥（X- linked agammaglobulinemia，XLA）屬于原發性體液免疫缺陷病中的一種，又叫Bruton病。近年來，由于Bruton酪氨酸激酶（Bruton’s agammaglobulinemia tyrosine kinase，BTK）基因突變導致B細胞發育障礙，所以不能產生免疫球蛋白。本文就近年來對BTK的遺傳學特性、基因突變分析、分子致病機制及診斷和治療等的研究進展作一綜述。

【關鍵詞】 X-連鎖無丙種球蛋白血癥（XLA）；Burton酪氨酸激酶（BTK）；診斷；治療

【Abstract】 X-linked agammaglobulinemia（XLA ）belongs to the primary immunodeficiency disease（PID），which calls Bruton disease.Recently，it can not generate immune globulin，because of the mutation of the Bruton’s agammaglobulinemia tyrosine kinase （BTK） gene，which leads to developmental disorder of the B cell.This article reviews the genetic characters，mutation analysis，molecular pathogenic mechanism and therapy of the BKT gene.

【Key words】 XLA；BTK；diagnosis；therapy

X連鎖無丙種球蛋白血癥（X-linked agammaglobulinemia，XLA），又稱Bruton無丙種球蛋白血癥，是最早發現的人類原發性免疫缺陷�。╬rimary immunodeficiency disease，PID）之一，Bruton（1952年）首次報道�；颊吲R床上以反復細菌感染為特征，血清中各類免疫球蛋白明顯降低或缺乏，對抗原刺激不能產生抗體應答，血循環中B淋巴細胞減少，淋巴結及淋巴組織缺乏生發中心和淋巴濾泡，骨髓中無漿細胞，但前B淋巴細胞數量正常，T淋巴細胞數量及功能正常。典型病例為出生后半年左右開始反復化膿感染（如肺炎鏈球菌或嗜血流感桿菌）或遲至幼年發病，患者體內缺少成熟B細胞，基本上不能自主產生免疫球蛋白，必須依靠免疫替代療法維持體液免疫水平。該病嚴重危害患者健康，危及患者生命。80%～90%［1］臨床診斷病例可檢出相關致病基因BTK發生突變，而其他10%～20%［1］的病人存在其他問題，有研究顯示常染色體編碼Igφ［2，3］、μHC［4］和LC的基因存在突變。

1 BTK的遺傳學特性大多數PID的遺傳形式已經明確，幾乎均為單基因遺傳，多數為常染色體隱性遺傳，其次為X連鎖隱性和常染色體顯性遺傳。大多數情況男性發病，女性攜帶，但也有男性攜帶者不發病的報道。60%的PID突變基因的DNA序列已被克隆，突變位點（包括突變基因定位的染色體節段和基因位點）和突變形式（單個核苷酸缺失、替代、插入、移碼突變、無義或錯義突變等）也已確定［5］。在WHO PID專家委員會的指導下，成立了有關疾病基因庫，記錄登記全球范圍的PID基因突變及其類型。多基因遺傳性PID的確定較困難，至今尚無確切的報道。

1.1 BTK的蛋白結構 BTK蛋白為B細胞信號傳遞系統中的重要蛋白，屬于非受體型蛋白酪氨酸激酶Tec家族的一員，該家族的成員還包括TEC、ITK/TSK/EMT和BMX。Tec家族蛋白酪氨酸激酶包括5個不同的結構區段（見圖1），從N末端起為PH（pleckstrin homology；PH）段，約有120個氨基酸，TH（Tec homology；TH）段約有60～80個氨基酸SH3（Src homology3;SH3）段約有60個氨基酸，SH2段約100個氨基酸，激酶催化段約280個氨基酸［6］。

圖1 BTK蛋白的組成（從N端開始）包括5個區域：PH、TH、SH3、SH2和激酶區。

注：圖上邊的數字代表各段的氨基酸長度，圖下邊的數字代表不同的外顯子及其相應的位置。

BTK蛋白的空間結構多數已測明，包括PH區、TH區的前半部、SH3區和激酶催化區［7］，SH2區的結構可借用其他蛋白激酶的類似結構進行研究。這些三維空間結構可用于分析突變造成的蛋白空間結構的改變。

1.2 BTK基因的分子結構及其突變分析 在20世紀80年代，多位學者應用DNA多態性標志分析的方法，成功地將XLA的缺陷基因定位于X染色體中部（Xq21.3-22）的2cm區域內［8］。Vetrie等用定位克隆方法在XLA病變基因區內分離鑒定了一個新的基因，該基因表達于正常人各期B淋巴細胞，在XLA患者中發生突變，故認為是XLA的致病基因。Tsukada等也找到XLA的KD致病基因。BTK基因全長37.5kb，含有19個外顯子，除第一外顯子外，其余18個編碼BTK蛋白的659個氨基酸，分子量為76KD［9］。cDNA含有2560個核苷酸，有一個編碼659個氨基酸多肽的開放閱讀框架，起始密碼子在核苷酸第133位置上，在起始位置上游的15個密碼子處閱讀框架閉合。根據國際研究小組BTK突變分析，迄今已經在471個家族544個XLA病人中發現了BTK基因341個獨立存在的堿基置換、插入或缺失，其中有13個大段缺失和2個大段插入。突變不僅存在于19個外顯子，還涉及內含子和啟動區域。其中，發生頻率最高的是錯義突變，其次是無義突變和拼接位點突變。錯義突變主要發生在三聯體密碼子的前兩位。外顯子8和9的185~287位沒有錯義突變，這些位點可能不易突變或是功能上不重要。33%的替代累及CPG雙核苷酸，這是目前認為的最常見的突變熱點［10］，而突變高頻位點R520也屬于CPG突變［6］。編碼外顯子蛋白突變的區域［11］（見表1）。表1 編碼外顯子蛋白突變的區域

2 BTK的分子致病機制BTK屬于非受體酪氨酸蛋白激酶，該類激酶廣泛參與細胞信號傳導，影響細胞的存活、增殖和分化，BTK是B細胞發育成熟的關鍵因素。正常人除T細胞和漿細胞外均有BTK表達，而BTK基因突變只影響B細胞的數量，這說明BTK在B細胞的生長發育過程中起著至關重要的作用。目前對BTK參與細胞信號傳導研究比較清楚的是BCR交聯介導的信號傳導途徑。其過程簡述如下：BCR交聯激活Pl-3激酶并產生一定數量的Pl-3，4，5-risphosphate與膜結合，Pl-3，4，5-risphosphate與BTK的SH3段作用使其定位于細胞膜。然后，BTK經過兩步活化：首先BTK激酶段Y551位磷酸化（很可能是與Lyn作用），接著是SH3段Y223位的自身磷酸化。活化后的BTK與B細胞銜接蛋白（BLNK）結合并激活phospholipase C -γy（PLC-γ），導致鈣離子通道打開，胞外鈣離子內流。該信號傳導途徑最終導致細胞增生加強和轉錄的變化。此模式僅限于以B細胞受體交聯作為刺激信號，至于前B細胞受體交聯是否也引起相同的信號傳導目前還缺乏證據［1，12］。該信號傳導途徑受FcRⅡB和SHIP（ SH2-containing inositol-5-phosphatase）磷酸酶介導的另一途徑制約，通過水解Pl-3，4，5-risphosphate和Ins（1，3，4，5）-etraphosphate關閉鈣離子內流通道［13］。BTK不僅可以由BCR和FCR介導激活，也可以通過其他很多受體激活，包括G-protein-coupled receptors（ GPCR）、IL-3、IL-5和IL-6，另外，CD19和單克隆抗體的交聯也可激活BTK［13］，近年來研究表明，CD40也是B細胞發育過程中的重要受體，傳遞刺激信號影響細胞存活、生長和分化。與BCR介導的BTK活化途徑相似，CD40的交聯也可激活BTK。CD40和BCR可能是B細胞發育過程中不同階段激活BTK的信號傳遞通路。但也有研究提示CD40不通過BTK也可提高NFKB和JNK的水平，是獨立于BTK的信號傳導通路［14～16］。BTK在細胞內與很多分子相互作用，共同構成了一種微環境，在信號傳導的過程中起著重要的作用。這些分子分別與BTK的不同區段相互作用，其中與PH段作用的分子研究得很多，R28附近區域與PIP3、IP4、PKCβⅠ、BP-135、F-ac-tin、STAT3和Fas作用。PH- TH區域與Gαq和Gβ雙體作用;SH3與c-Cb1、WASp、Vav和sab作用;SH2與磷酸化的BLNK作用。另外，SH3與TH在BTK分子內作用，抑制BTK的活性。在BCR交聯介導的信號傳導途徑中，Syk和BLNK對BTK的活化起正向調節作用，磷酸化的PKCs、sab和IBTK對BTK的活化有抑制作用。盡管與BTK作用的分子很多，但是它們如何協調地與BTK作用，完成BTK參與的信號傳導，機制目前尚不清楚［17，18］。

　　3 XLA的診斷XLA是一種原發性體液免疫缺陷癥，危害著人們的健康。因而，對該癥進行產前診斷和女性攜帶者的鑒定就顯得十分重要［19］。為了研究XLA家系女性成員的情況，Fearon等采用了X染色體失活的方法去發現攜帶狀況以及驗證B淋巴細胞發育的內在缺陷。根據這一方法用重組DNA探針同時發現RFLP和X染色體基因甲基化。在無攜帶狀態的女性的外周血粒細胞、T淋巴細胞和B淋巴細胞中發現X染色體的隨機失活。相反，該癥的三個攜帶者在外周B淋巴細胞兩個X染色體中的一個優先失活，但不是T細胞或粒細胞。這一發現強烈地支持XLA是由B淋巴細胞發育的內在缺陷所致的假設。Lovering （1994）等［20］對BTK基因缺失患者DNA分子斑點雜交分析見到了已改變的DNA限制性片段，并對7個患者家庭用已經改變的限制性片段方法對與患者有關的女性攜帶狀況作出診斷。隨后，Schuster等［21］報道了對所有19個外顯子。包括側翼內含子邊界采用PCR-SSCP方法成功地檢測到兩例男性患兒BTK的SH2功能區的新突變，并用一個已改變過的第一個引物做PCR擴增突變發生，作出三代中健康女性攜帶者的鑒定。接著，Hagemann等［22］對一個散發的XLA患兒及家庭的三代成員應用PCR擴增基因組DNA，采用序列分析的方法直接鑒定XLA的基因突變，結果診斷出患兒及其免疫學表現正常的女性攜帶者。以上這些方法均可應用于產前診斷。這無疑對優生優育是很有意義的。

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